Мозг. Такой ли он особенный?

2. Мозговой суп

Таким было положение вещей, когда я заинтересовалась, из чего состоит головной мозг и чем замечателен человеческий мозг в сравнении с другими: оказалось, что никто не занимался такими сравнениями. Дело в том, что при таком впечатляющем списке необычностей мы, конечно, были особенными.

Меня, молодого биолога, такая ситуация сильно удручала. Удручало то, что многие мои коллеги-неврологи принимали утверждение о человеческой уникальности без рассуждений, не пытаясь даже его как-то обосновать. Со времен Дарвина мы стремимся понять правила, приложимые ко всем живым существам, понять ограничения, которым подвержена любая живая материя. Мы осознали, что за фасадом разнообразия всех млекопитающих стоит основной, наследуемый набор генов, который это многообразие ограничивает: яблоко не может упасть далеко от яблони. Но если эти эволюционные ограничения накладываются и на людей, то как смог человеческий мозг, он один, быть одновременно таким же объектом эволюционных законов, как и мозг других видов, но и совершенно другим, обладающим способностями оценивать материал, из которого мы состоим, и искать, и находить метафизические истоки нашего существования, в то время как другие животные, в буквальном смысле слова, живут накрепко привязанные к земле?

К первому десятилетию двадцать первого века необычные признаки, такие как относительный размер, величина потребления энергии и генетический набор, определяющий развитие головного мозга, казались необходимыми для объяснения наших удивительных когнитивных способностей, потому что те скудные данные, что были получены в предыдущем столетии относительно сравнения человеческого мозга с мозгом других животных, снова и снова подтверждали, что в мозге человека нет ничего особенного. По техническим причинам сравнение ткани мозга разных биологических видов в течение десятилетий ограничивалось оценкой плотности нейронов на срезах мозговой ткани, то есть оценивали число видимых под микроскопом нейронов на срезе определенной площади. Немногочисленные ученые, и среди них Дональд Тауэр и Герберт Хауг, исследовали плотность нейронов в коре головного мозга самых разнообразных видов млекопитающих и не обнаружили в мозге человека ничего такого, что принципиально отличало бы его от других млекопитающих. С точки зрения анатомии это означало, что вещество нашего мозга по своему строению не слишком сильно отличается от строения мозга других животных. Если это так, то наше превосходство может объясняться чем-то другим, выходящим за рамки обычного, как, например, относительным избытком массы мозговой ткани по отношению к массе тела или относительно большим потреблением энергии, как если бы мозг был высокоскоростным компьютером.

Возможно, однако, причина того, что человеческий мозг кажется таким обыкновенным, заключается в том, что людей просто сравнивали не с теми видами, как, например, сравнивали бы яблоки с апельсинами. В своей первой работе Дональд Тауэр^[43], а позднее Герберт Хауг^[44] позволили себе вольность сравнивать мышей, кроликов, кошек, коров, китов, обезьян и людей друг с другом, не считаясь с возможностью того, что если существуют очевидные различия между грызунами, хищниками, парнокопытными, китообразными и приматами, то, вероятно, между ними могут наблюдаться по меньшей мере некоторые внутренние отличия, которые, возможно, распространяются и на их мозг. Гарри Джерисон поступил так же, как упомянутые авторы. Такие сравнения находились в полном согласии с основополагающим допущением о том, что мозг всех млекопитающих устроен в принципе одинаково, что находит свое выражение в общем соотношении между размером мозга и числом нейронов, – и по этому признаку мозг человека не отличается от мозга других млекопитающих. Хотя об этом никогда не говорили прямо, в двадцатом веке, что следует из обычной практики неразборчивого сравнения мозгов самых разнообразных видов, господствовала надежда на то, что мозг всех млекопитающих – крупных и мелких – был увеличенным или уменьшенным вариантом одного и того же основного плана строения.

Но что если это не соответствует действительности?

Действительно ли все мозги устроены одинаково?

Давайте на время забудем об энцефализации, расточительном потреблении энергии и, отступив, снова попробуем разобраться в фундаментальных вещах. Немного критического мышления достаточно для того, чтобы понять, что все мозги не могут быть устроены одинаково и характеризоваться одинаковым и универсальным отношением между размерами мозга и числом нейронов. Естественно, каждый мозг состоит из нейронов, мельчайших счетных единиц, обрабатывающих информацию и передающих ее в крупные обширные сети, которые нейроны образуют в головном мозге. Информация попадает в нейроны через синапсы, причем на каждый нейрон приходится от 10 до 100 тысяч синапсов. Информация, проходящая через все эти синапсы, сходится на теле нейрона, который затем обрабатывает ее и передает результат следующему нейрону. Несмотря на то что обладание многими синапсами увеличивает гибкость в обработке информации и повышает ее возможную сложность, разумно предположить, что в конечном итоге счетная способность мозга данного биологического вида в гораздо большей степени лимитирована числом нейронов, нежели числом их синапсов^[45].

Если бы у всех млекопитающих мозг был устроен одинаково, то два мозга одинаковой величины содержали бы одинаковое число нейронов, одинаковым образом распределенных по структурам мозга. И если числа нейронов ограничивают когнитивные способности, то коровы и шимпанзе, обладающие мозгом массой около 400 г, должны, по этой идее, обладать сходными умственными способностями. Однако очень трудно изобрести способ сравнения когнитивных способностей животных разных видов. Когнитивные тесты должны быть экологически значимыми для испытуемого вида: надо учитывать не только частные интересы вида, но и анатомическое строение тела (имеет ли животное копыта, когти, пальцы или крылья), а потом перевести полученные данные на стандартный язык для возможности сравнения^[46]. К слову сказать, мы достаточно хорошо знаем оба этих вида и можем заподозрить, что шимпанзе отличаются от коровы намного более богатым, гибким и сложным поведенческим репертуаром. Если, конечно, коровы не живут очень насыщенной внутренней жизнью и настолько умны, что не позволяют нам видеть, как они предаются глубоким размышлениям, когда пасутся на лугах. Это весьма маловероятно, учитывая, что коровы, предназначенные на убой, мирно пасутся, а шимпанзе, живущие в неволе, изобретают массу трюков, чтобы одурачить служителей зоопарков. Отсюда ясно, что два мозга сравнимого размера отнюдь не обязательно обладают сходными когнитивными способностями.

Но давайте продолжим, потому что дальше все становится еще хуже. Если бы мозги всех млекопитающих были устроены одинаково, отличаясь только размерами общего, универсального плана, то тогда мозги большего размера должны обладать большим числом нейронов, чем маленькие мозги, а поскольку нейроны являются элементарными счетными единицами мозга, постольку более крупный мозг, по одной этой причине, должен обладать большими когнитивными способностями. Но выясняется самая досадная из всех проблем, имеющих отношение к размеру мозга: человеческий мозг не является самым большим. Более того, он далеко не дотягивает до звания чемпиона по размеру и массе мозга, и поэтому вычисление коэффициента энцефализации было встречено с таким энтузиазмом: этот показатель, как казалось, помогал разрешить этот парадокс. По меньшей мере у тринадцати видов мозг такой же, как у нас, или весит больше наших полутора килограммов, а самый большой мозг, массой 9 кг, обнаружен у кашалота, таким образом, он в шесть раз больше нашего. Однако превосходят нас не только китообразные: мозг африканского слона весит около 5 кг, то есть более чем в три раза больше, чем наш.

Эти нестыковки указывают на то, что не все мозги устроены одинаково, не являются объектами одного масштаба, – именно это заставило меня заподозрить, что мы не знаем, как именно устроены мозги животных разных биологических видов. Несмотря на то что в литературе описано множество исследований, касающихся объема и площади поверхности мозга различных видов^[47], а также есть масса статей, посвященных плотности нейронов в мозговой коре^[48], данные о числе нейронов в мозге весьма скудны. В частности, я не смогла найти оригинальный источник, подтверждающий часто повторяемое число «100 миллиардов нейронов человеческого мозга». В лучшем случае это можно считать лишь приблизительной оценкой порядка величины. В 1988 году Роберт Уильямс и Карл Херруп оценили число нейронов человеческого мозга величиной «около 85 миллиардов нейронов», основываясь на подсчетах, сделанных для коры головного мозга и мозжечка, но этих авторов постоянно неверно цитируют, утверждая по-прежнему, что число нейронов в человеческом мозге составляет круглую величину в 100 миллиардов клеток. В 2003 году я консультировалась с несколькими уважаемыми неврологами, большинство которых верует в 100 миллиардов, но ни один из них не смог указать мне оригинальный источник этого числа. Позже я встретилась с самим Эриком Кэнделом, в чьем классическом учебнике «Принципы неврологии»^[49] приведена та же цифра с добавлением: «…и в 10–50 раз больше глиальных клеток». Когда я спросила Эрика, откуда он взял эти данные, он сослался на своего соавтора Тома Джессела, писавшего главу, в которой они приведены, но я так и не смогла поговорить с самим Джесселом. Очевидно, была выполнена частичная аппроксимация, которую приняли за допустимый порядок величины, и стали оперировать ею, как реальным числом. Шел уже 2004 год, но никто точно не знал, сколько на самом деле нейронов содержится в человеческом мозге.

Теперь думается, что десятикратное численное превосходство глиальных клеток является еще большим мифом, чем представление о 100 миллиардах нейронов. Согласно мифу, если в мозге в целом действительно содержится 100 миллиардов нейронов, то в нем должен быть и один триллион глиальных клеток. К 2004 году было уже известно, что на каждый нейрон серого вещества церебральной коры человека приходится менее двух глиальных клеток, а в мозжечке этот показатель еще ниже – 0,1 клетки^[50]. Это означало, что один триллион глиальных клеток должен располагаться в полосатом теле, промежуточном мозге и стволе головного мозга, то есть в структурах, которые все вместе весят меньше 200 г. Если бы это было так, то на 1 мг мозговой ткани должно приходиться около пяти миллионов глиальных клеток, но, по всем данным, полученным к 2004 году, плотность глиальных клеток ни в одном отделе мозга не превышала 100 тысяч на 1 мг мозговой ткани. Популярная оценка в 100 миллиардов нейронов и в десять раз большего числа глиальных клеток человеческого мозга, как мне кажется, стала результатом игры ученых в испорченный телефон, когда ранняя приблизительная оценка числа нейронов и отношения глия/нейроны вышла из-под контроля, и удобное круглое число прочно завладело воображением неврологов, нейрофизиологов и широкой публики.

Одной из причин отсутствия фактических и достоверных оценок числа клеток является то, что единственным относительно надежным способом подсчета клеток в то время был стереологический метод с использованием, например, «оптического фракционатора». Этот метод в то время считался самым надежным. Оптический фракционатор состоит из введенных в тонкий срез ткани виртуальных трехмерных зондов, которые выделяют известную малую долю всего объема ткани; потом подсчитывают число клеток в пробе, а затем экстраполируют результат и получают общее число клеток во всем объеме ткани. Этот метод очень хорош для тканей с относительно равномерным распределением клеток или, по крайней мере, с небольшими вариациями плотности в разных участках пробы. В высшей степени гетерогенное распределение нейронов в разных структурах головного мозга, однако, делает стереологические методы малопригодными для этой цели – для определения числа клеток в целом мозге. Плотность нейронов может варьировать, различаясь в тысячу раз в области ствола и в мозжечке. Даже внутри одной и той же структуры, например в мозжечке, в различных слоях нейроны упакованы с разной плотностью. Для того чтобы в такой ситуации пользоваться стереологическими методами, необходимо разделить мозг на сотни структур сравнимой плотности, а затем взять из них очень большое число проб. Это было бы непомерно дорого даже для крупной лаборатории. Мне же было еще труднее, потому что у меня не было ни лаборатории, ни денег.

Как считать клетки, не имея лаборатории?

Когда я впервые занялась подсчетом клеток, я не была нейроанатомом и стереология была очень далека от сферы моих интересов. В 2003 году у меня не было лаборатории, не говоря уже о деньгах. Тогда я всего год работала в Федеральном университете Рио-де-Жанейро в должности ассистента профессора научной информации. Приблизительно такой же работой я занималась предыдущие три года в Музее науки в Рио, после весьма многообещающего начала научной карьеры. Бакалавриат я заканчивала по специальности «вирусология» в Федеральном университете в Рио, затем поработала в генетической лаборатории в Кливлендском университете, после чего подруга увлекла меня нейробиологией, и я занялась вопросами развития нервной системы, что продолжалось два года в лаборатории Кливлендского университета, где я прошла магистратуру. Потом я уехала в Германию, где получила степень доктора философии по нейрофизиологии зрения, работая в лаборатории Вольфа Зингера в Институте исследования мозга имени Макса Планка во Франкфурте. Решив не заниматься дальше осцилляторными ответами нейронов, я уехала в Рио, к своему тогдашнему мужу, где устроилась на должность приглашенного ученого в Музей Жизни. Мой муж в то время, после защиты докторской диссертации, работал в университете в лаборатории Роберто Лента. В течение трех лет после возвращения в Рио я руководила практическими занятиями детей, приходивших в музей, создала сайт и написала мою первую книгу по нейробиологии для широкого круга читателей, в результате чего меня пригласили на работу в альма-матер. Первым моим заданием стало руководство молодыми учеными на ниве научных коммуникаций, но в отделе кадров мне намекнули, что я, если пожелаю, смогу заниматься и научной деятельностью.

Я сразу же ухватилась за это предложение. Мое любопытство подстегивалось литературными изысканиями по теме, которая захватила меня во время работы в музее. Я подумала, что лучшим способом приступить к работе будет непосредственное знакомство с посетителями и выяснение вопроса о том, что они знают о мозге. Сказано – сделано: в 1999 году я провела среди 2000 респондентов опрос на тему: «Знаете ли вы свой мозг?»^[51]. Это был отпечатанный вопросник из 95 коротких утверждений типа: «Сознание невозможно без мозга», «Наркотики вызывают зависимость, потому что действуют на мозг» и «Разум – продукт духа, а не мозга», на которые были даны по три ответа: «Да», «Нет», «Не знаю». Одно из утверждений выглядело так: «Мы используем только 10 % своего мозга» – на него 60 % уроженцев Рио ответили «да». Я была удивлена: я знала, что эту броскую фразу часто использовали в научно-популярных журналах и даже в публицистике, но не догадывалась, что она настолько захватила воображение публики, особенно при том, что это миф. Мы все время, каждую секунду используем все 100 % нашего мозга, учась, развиваясь, достигая великих целей и даже во сне. Просто в разные моменты времени мы используем его по-разному.

Но что если только 10 % – или даже меньше – клеток мозга – это нейроны? В «Принципах нейробиологии» было сказано следующее: мы располагаем 100 миллиардами нейронов и в 10–50 раз большим числом глиальных клеток, и это стало таким общепринятым «фактом», что нейробиологам было вольно начинать свои обзорные статьи с упоминания этого факта, но без всяких ссылок на источники. Это мнение стало эквивалентным утверждению, что гены состоят из ДНК, – это превратилось в избитую, известную всем «истину». Но если у нас в десять раз больше глиальных клеток, чем нейронов, то нейронов у нас приблизительно 10 % от всех клеток мозга, и если нейроны – это те клетки, которые нужны для осуществления когнитивных функций (от этого высказывания у специалистов по глии округлились бы глаза), то на самом деле можно говорить о том, что мы используем только 10 % всех клеток головного мозга.

Но что если это все-таки неправда?

Я перелистывала литературу в поисках оригинальных исследований о том, сколько клеток содержится в мозге, и чем больше я читала, тем лучше понимала, что того, что я ищу, попросту не существует. При великом множестве идей на эту тему и даже при кажущемся всеобщем согласии мы в действительности не понимали того, насколько много клеток в мозге, и еще меньше понимали, как следует сравнивать человеческий мозг с мозгом животных других видов.

Стереология не дала ответа на этот вопрос и, скорее всего, не даст, и к тому же я не имела возможности ею заняться. Но что если ею и не надо заниматься? Среди прочитанного мной я наткнулась на сделанные в семидесятые годы попытки определить количество клеток в мозге путем экстракции ДНК из ткани мозга, определения ее количества и деления полученного результата на среднее содержание ДНК в клеточных ядрах. Действительно, таким образом можно было оценить число клеток в мозге^[52]. Да, это должно было сработать, но единственное, о чем я могла думать, – это о том, как мои преподаватели и наставники, выделяя ядра из клеточных культур, говорили: «Нет, не надо мерить количество ДНК, надо считать ядра!» У меня тем не менее появилась идея. Я решила превратить мозг в суп.

Ответ плавает в супе

Чтобы преодолеть главное препятствие при подсчете клеток мозга – гетерогенность их распределения в ткани, я буквально растворила эту гетерогенность в детергенте. Я решила, что если мне удастся растворить в тканях только клеточные мембраны, но оставить в неприкосновенности ядерные мембраны, то я смогу превратить мозг в суп со свободно плавающими в нем клеточными ядрами, которые можно легко посчитать, набрав для этого всего несколько аликвот (небольших объемов) взвеси, которую можно гомогенизировать простым встряхиванием. Так как каждая клетка в головном мозге располагает одним и только одним ядром, то если мне удастся узнать, сколько в мозге клеточных ядер, одновременно я узнаю, сколько в нем клеток. Если бы только у меня была лаборатория…

Роберто Лент, заведующий отделом анатомии и один из руководителей, взявших меня на работу, определенно располагал лабораторией – и, по иронии судьбы, он в это время заканчивал работу над учебником, называвшимся по-английски «Сто миллиардов нейронов». Когда я спросила его, откуда он взял это число, Роберто, как я и ожидала, не смог ответить. «Как бы вы отреагировали, если бы я сказала вам, что знаю, как правильно посчитать клетки?» Роберто отреагировал великолепно. Он не только выслушал мою странную идею, но и дал мне место в своей лаборатории, разрешив пользоваться оборудованием и расходными материалами, несмотря даже на то, что, если моя идея оказалась бы верной, ему пришлось бы менять название руководства (что он позже и сделал), и это получилось у него очень легко. Правда, первое издание уже с успехом разошлось в Бразилии к тому времени, когда был получен результат, но в следующих изданиях к заглавию был просто добавлен вопросительный знак: «Сто миллиардов нейронов?».

На полке в лаборатории валялся забытый кем-то кухонный блендер, а человеческие мозги можно было без труда взять в отделении патологической анатомии в соседнем университетском корпусе. Конечно, я планировала начать с растворения мозгов мышей и крыс, что на первых порах исключало использование блендера; тем не менее каждый раз, входя в лабораторию, я бросала взгляд на блендер и спрашивала себя: «Неужели в один прекрасный день я действительно брошу человеческий мозг в блендер и разотру в мелкий порошок то, что составляло самую сущность человека?» Картина грубого, быстрого и полного уничтожения человеческого мозга не давала мне покоя. Но я все-таки убедила себя, что в конечном счете растворение мозга не так уж сильно отличается от его разрезания на десятки тысяч мелких кусочков, что рутинно делают все анатомы для того, чтобы готовить тонкие срезы мозга для микроскопических исследований. Разница заключалась в том, что это будет не разрезание на мелкие кусочки, а растворение с разделением ткани мозга на еще более мелкие части, на клеточные ядра. Кроме того, по протоколу исследования мне не надо было бросать в блендер большие куски мозга. Скорее, это было похоже на приготовление льда: мозг предстояло рассечь на тонкие пластинки, пластинки на мелкие кубики, а уже кубики растереть в мелкую кашицу.

Вначале мне все же пришлось использовать маленький блендер. Выделение клеточных ядер – это стандартная биохимическая процедура, и я воспользовалась протоколом, который предусматривал глубокое замораживание крысиных мозгов в жидком азоте, для того, чтобы расщепить клеточные мембраны, а затем твердые куски ткани я помещала в ручной блендер. Результат было легко предвидеть: кусочки замороженного крысиного мозга разлетались по всей лаборатории. Превращение же мозга в суп и подсчет всех клеток будут возможны только в том случае, если мне удастся не потерять ни единого ядра. Потери кусочков замороженного мозга, пусть даже они прилипали к крышке блендера, были абсолютно неприемлемы.

Измельчение слегка зафиксированной ткани в ручном стеклянном гомогенизаторе (рис. 2.1) было намного более перспективным. Фиксация в формальдегиде сшивает молекулы белков в тканях, делает их жесткими и прочными. Поскольку ядерная мембрана содержит много белка, она очень хорошо фиксируется формальдегидом и приобретает устойчивость к мощным физическим воздействиям. Первые попытки со свежими, незафиксированными тканями показали мне, что представляют собой разрушенные ядра: они превращались в хлопья свободной ДНК, которая под микроскопом выглядит окрашенной в синий цвет, так как для окраски ядер я применяла краситель DAPI. Препараты из фиксированных в течение всего нескольких часов тканей сохраняли большую долю интактных ядер, но все же многие из них разрушались.

Рис. 2.1. Стеклянный гомогенизатор тканей выглядит как стеклянные цилиндрические ступка и пестик. В таком устройстве гомогенизируют (размалывают до гомогенного состояния) ткань головного мозга

Я нашла решение после того, как начала фиксировать ткани в течение двух недель. Эта идея спасла всю работу: если даже короткая фиксация сохраняла какое-то количество ядер целыми, предохраняя их от разрушения в гомогенизаторе, то тщательная, длительная фиксация делала ткани плотными, как камень, и можно было надеяться, что все до единого ядра оставались целыми в процессе обработки, а это и было целью всего предприятия. Наконец все сработало: когда в каждом опыте я стала получать приблизительно одинаковое число ядер, я поняла, что у меня получился новый, весьма эффективный метод подсчета клеток.

После некоторого обдумывания таких деталей, как сбор ядер и перенос в градуированные пробирки без ощутимых потерь, у меня в руках был стабильный протокол опытов. Он состоял из рассечения твердого, фиксированного мозга на более мелкие, анатомически и функционально значимые области, например на кору целиком, мозжечок, обонятельные луковицы и «остальное» (пока). После взвешивания каждая часть рассекалась на тонкие срезы, затем на мелкие кубики, что облегчало процесс растирания: оно производилось в среде детергента Тритон-Х100 между стеклянными стенками гомогенизатора, что позволяло разрушать клеточные мембраны, но сохранять мембраны ядерные. Двадцать минут вращательно поступательных движений поршнем в цилиндре – и я получала мутную, но без хлопьев жидкость, содержащую взвесь ядер. Мозг был окончательно превращен в суп. Следующий шаг заключался в тщательном сборе ядер – не должно было пропасть ни одно ядро, подлежащее учету. Для этого я несколько раз промывала поршень в цилиндре, потом отсасывала пипеткой ядерный осадок на дне цилиндра, затем снова промывала поршень, снова отсасывала жидкость и так несколько раз, до тех пор пока не получала определенный объем, содержащий все ядра. К этой жидкости я добавляла краситель для окрашивания ДНК, а затем физиологический раствор до объема, который можно было легко определить в градуированном цилиндре. Окрашивание остатка последней промывной жидкости после окрашивания DAPI позволяло убедиться в том, что в гомогенизаторе не осталось больше ядер. Все ядра всех клеток ткани – окрашенные и собранные – находились теперь в известном объеме, готовые к подсчету. Теперь оставалось только встряхнуть суспензию, чтобы равномерно распределить ядра по объему, а потом выбрать несколько аликвот для подсчета и экстраполировать результат на весь объем.

Подсчет свободных клеточных ядер методом флуоресцентной микроскопии не требует специальной подготовки: ядра – это округлые объекты, превосходящие размерами бактерии и митохондрии. Пользуясь гемоцитометром, представляющим собой закрываемую покровным стеклом камеру, имеющую объем 4 нл (4 миллионных доли миллилитра), на дне которой вырезано 25 квадратных углублений, я могла легко посчитать, сколько ядер находилось в 100 нл взвеси, и по пропорции вычислить, сколько ядер содержится во всем известном объеме. Для подсчета ядер под микроскопом в четырех аликвотах у меня уходило 10 минут. Учитывая, что я делала суспензию гомогенной легким встряхиванием перед отбором аликвот, коэффициент вариации составлял меньше 0,10, то есть стандартное отклонение четырех подсчетов составляло не более 10 % от среднего числа клеток в каждой из четырех проб. При таком небольшом отклонении оценка общего числа клеток была так же надежна, как и подсчет клеток стереологическим методом.

Имея на руках число клеток, я воспользовалась тем преимуществом, что существуют антитела, которые специфически связываются с белком, который экспрессируется исключительно в клеточных ядрах нейронов и только в них. Этот белок называют нейрональным ядерным белком (neuronal nuclear protein – NeuN). Он был открыт в 1992 году^[53], когда его функция была еще неизвестна^[54]. У NeuN есть одно важное свойство, которое позволило мне надежно считать экспрессию NeuN маркером всех нейронов, и только нейронов, – присутствие NeuN можно выявить связыванием его специфическими антителами, окрашенными красным красителем и добавленными в суспензию. Это потребовало реакции небольшого количества суспензии с меченными красным красителем анти-NeuN-антителами, и спустя несколько часов я уже могла снова поместить ядра под микроскоп для того, чтобы определить, какой процент всех ядер (окрашенных ранее в синий цвет) принадлежал нейронам (которые теперь были окрашены в красный цвет). Подсчета 500 ядер (что заняло ровно пятнадцать минут) хватило для определения процента нейронов с точностью до 0,2 %. Приложив это процентное отношение нейронов к общему числу клеток в выбранных структурах, я получила общее число нейронов в них. Вычтя это число из общего количества клеток, я получила число всех остальных клеток в ткани (вероятно, это было число глиальных клеток). Сложив результаты, полученные для каждой структуры – а я начала с простого разделения целого мозга на мозговую кору, мозжечок и все остальное, – я впервые в истории получила прямую оценку общего числа нейронов и других клеток в целом мозге крысы. Вся процедура была выполнена меньше чем за один рабочий день.

Я была страшно взволнована. Я теперь знала то, чего в этот момент не знал ни один человек в мире: сколько клеток содержится в целом мозге крысы.

Возник, правда, еще один вопрос: насколько достоверны эти данные, а достоверность в нейроанатомии означает сравнение полученных данных с данными, полученными стереологическим методом. Сравнение было невозможно для тех областей мозга, которые недоступны стереологическому исследованию; в конце концов главной целью создания нового метода и была возможность исследовать те области, где была неприменима стереология. К счастью для нас, в литературе нашлось несколько работ со стереологическими оценками количества нейронов в коре и мозжечке крысиного мозга. Наши результаты были сопоставимы с данными этих работ.

В 2004 году Карл Херруп, работавший в то время в Кливлендском университете, приехал на организованный Роберто и мною в Кашамбу (Бразилия) симпозиум, посвященный важности проблемы определения числа клеток в головном мозге. Карл давно интересовался подсчетом клеток в мозжечке – это его любимый отдел мозга, – но оставил эту идею в связи с отсутствием адекватного метода (мозжечок является плохим объектом стереологического метода из-за высокой плотности расположения крошечных нейронов в зернистом слое, которые расположены настолько тесно, что сливаются при рассматривании их под микроскопом). Карл был научным руководителем одной моей близкой подруги, и благодаря этому я когда-то смогла получить место в его лаборатории и всегда считала его моим неофициальным наставником. Когда в Кашамбу я объяснила Карлу суть моего метода подсчета мозговых клеток, он улыбнулся: «Я думал о чем-то подобном несколько лет назад. Я хотел использовать цитометрию в потоке для подсчета клеток, выделенных из ткани. Но серьезно этой проблемой я так и не занялся. Вы меня опередили, и я рад, что у вас это получилось!» Узнав, что статья о работе уже готова, но не опубликована, Карл сразу же вызвался стать ее редактором в Journal of Neuroscience. А в 2005 году после тщательного обсуждения статьи коллегами Роберто и я получили оттиск статьи, напечатанной в одном из самых авторитетных журналов в этой области биологии^[55].

Несмотря на то что превращение мозга в суп для подсчета общего числа клеток в мозге давало результаты, сравнимые с таковыми, полученными стереологическим методом (там, где такие результаты были), а полученные данные становились все более и более убедительными по мере того, как мы анализировали мозг других биологических видов, наш метод столкнулся с довольно сильным сопротивлением со стороны некоторых специалистов, особенно тех, кто видел, как их любимые теории рушатся перед лицом данных об ином количестве клеток в мозге. Рецензенты и критики хотели видеть одно и то же доказательство – параллельное сравнение нового метода с проверенным стереологическим методом. Я не имела опыта в стереологии, поэтому самостоятельно не смогла бы осуществить такое сравнение еще в течение многих лет. Однако в конце концов, что было к лучшему, не я доказала нашу правоту. Это было сделано независимо от нас в 2014 году Кристофером фон Бартхельдом из университета Рено, а также Дэниелом Миллером и моим будущим сотрудником Джоном Каасом из университета Вандербильта в Нэшвилле^[56]. С тех пор как мы с Джоном начали сотрудничать в 2006 году, в его лаборатории была разработана автоматизированная модификация нашего метода подсчета клеток с применением флоуцитометра^[57]. Джон и Крис показали, что, по меньшей мере, наш новый метод превращения головного мозга в суп не только так же точен, как стереологический, но он требует меньше времени, более надежен и прост в выполнении^[58]. Кроме того, как и было задумано, наш метод позволял получать надежные результаты для сложных гетерогенных структур, как, например, головной мозг, которые невозможно анализировать стереологическими методами^[59].